Лечение генетических заболеваний за границей. Генетика человека: понятие, основы, методы изучения Роль генетики в изучении генома человека

5710 0

Существует точка зрения, которую разделяет немалое число специалистов, что все заболевания человека за исключением травм связаны с генетическими дефектами. Очевидно, это крайняя точка зрения, тем не менее она отражает важность генетических факторов в определении состоянии здоровья людей. Генетические дефекты бывают разной значимости и состояния.

Хотя обычно считают диабет и мышечную дистрофию заболеванием, а расщепление неба или цветовую слепоту - наследственными дефектами - все это является результатом мутаций в генетическом материале. Показано также, что предрасположенность к заболеванию также зависит от генетической конституции.

Генетические дефекты или мутации в последовательности ДНК выражаются в замене одного нуклеотида другим, потере целого фрагмента или его переносе на другое положение в геноме и пр. Такие изменения могут привести к изменениям структуры (и функции) белка, который кодируется данным фрагментом ДНК или к изменению регуляторных участков генов, гибельным для клеток. Говоря о наследственных заболеваниях, мы имеем в виду мутации, которые появляются в половых клетках и передаются потомству.

В соматических клетках на протяжении жизни также накапливаются мутации, которые могут стать причиной заболевания, но они по наследству не передаются. Ранее считалось, что все мутации вредны. Это связано с тем, что именно с таких мутаций, вызывающих заболевания, было начато изучение генетических характеристик человека. Но сейчас, когда прочитан практически весь нуклеотидный текст человека, стало ясно, что большая часть мутаций является нейтральной. Вредные мутации, приводящие к грубому нарушению развития организма, отсеиваются отбором - их носители не выживают или не дают потомства.

Огромный прорыв в понимании, как унаследованные гены влияют на физические и психологические особенности человека, произошел за последние десятилетия благодаря открытиям, сделанным при исследовании генома человека. Установлены и диагностируются как целый ряд генетических заболеваний, так и предрасположенность к ним, причем на самых ранних этапах развития эмбриона. Большие надежды на расширение возможностей современной медицины связаны с реализацией проекта «Геном человека».

Реализация научного проекта «Геном человека»

Научный проект «Геном человека» - это международная программа, конечной целью которой являлось определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). В 1988 г. Министерство энергетики США и Национальный институт здоровья США представили обширный проект, в задачи которого входило секвенирование геномов человека, а также бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши - организмов, которые широко использовались в качестве модельных систем в изучении генетики человека.

На реализацию этого проекта Конгресс выделил 3 млрд дол. (по одному доллару за каждый нуклеотид человеческого генома). Директором проекта был назначен лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон. К проекту присоединились другие страны - Англия, Франция, Япония и др.

В 1989 г. по инициативе академика А.А. Баева в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека». В 1990 г. была создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д. Мирза-беков. Независимо от вклада и государственной принадлежности отдельных участников программы с самого ее начала вся получаемая ими в ходе работ информация была открыта и доступна для всех его участников.

Двадцать три хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские ученые должны были исследовать структуры 3-й и 19-й хромосом. Однако вскоре финансирование работ по этому проекту было сильно сокращено, и реального участия в секвенировании наша страна не принимала. Тем не менее работы по геномному проекту в нашей стране не прекратились: программа была пересмотрена и сконцентрирована на развитии биоинформатики -математических методов, вычислительной техники, программного обеспечения, совершенствовании способов описания и храненеия геномной информации, которые бы помогли понять и осмыслить расшифрованную информацию.

На расшифровку генома человека было отведено 15 лет. Однако постоянное развитие технологии секвенирования позволило завершить проект на 2 года раньше. Немалую роль в интенсификации работ сыграла частная американская компания Celera, возглавляемая Дж. Вентером (в прошлом - биолог Национального института здоровья США). Если в начальные годы осуществления проекта по всему миру секвенировали несколько миллионов нуклеотидных пар в год, то в конце 1999 г. Celera расшифровывала не менее 10 млн нуклеотидных пар в сутки. Для этого работы велись круглосуточно в автоматическом режиме 250 роботизированными установками, информация сразу же передавалась в банки данных, где систематизировалась, аннотировалась и выкладывалась в Интернет.

При проведении работ в 1995 г. Вентер с соавторами разработал и опубликовал совершенно новый подход к секвенированию генома, названный методом произвольного секвенирования полного генома (более известный как произвольное секвенирование методом дробления), который позволял собрать полный геном из частично секвенированных фрагментов ДНК при помощи компьютерной модели.

Этим методом впервые был полностью секвенирован геном самореплицирующегося свободно живущего организма - бактерии Haemophilus in-fluenzae Rd. Копии ДНК бактерии были разрезаны на куски произвольной длины от 200 до 1 600 п.о. Эти фрагменты секвенировали по несколько сот с каждого конца. Кроме того, были секвенированы и более длинные фрагменты по 15-20 тыс. п.о. Полученные последовательности были внесены в компьютер, который их сравнивал, распределял по группам и по сходству.

Первыми идентифицировались неповторяющиеся последовательности, затем -повторяющиеся последовательности фрагментов. Длинные фрагменты помогали установить порядок часто повторяющихся, почти идентичных последовательностей. Затем заполнялись пробелы между полученными основными кусками ДНК. Секвенирование генома Haemophilus influenzae заняло один год и при этом была определена последовательность 1 830 137 п.о. и 1 749 генов, расположенных на 24 304 фрагментах.

Это был несомненный успех, который доказал, что новая технология может быть применима для быстрого и точного секвенирования целых геномов. В 1996 г. картировали геном первой эукариотической клетки - дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном многоклеточного организма - круглого земляного червя Caenorhabolits elegans.

В феврале 2001 г. рабочий вариант генома человека (выполненный на 90 %) был одновременно опубликован в журналах «Nature» - результаты HUGO и «Science» - результаты исследований компании Celera. Анализ полученного варианта генома человека выявил около 25 тыс. генов. Ранее предполагалось, что это количество должно достигать 140 тыс. (если исходить из постулата «один ген кодирует один белок»). В настоящее время представляется возможным, что один ген может кодировать 5-6 белков. Многообразие белков, кодируемых одним и тем же геном, обеспечивается несколькими механизмами: с помощью альтернативного сплайсинга, посттрансляционных превращений белков - фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многих других.

В 2003 г. был опубликован окончательный вариант полной последовательности генома человека. Вся эта информация является доступной и находится в Интернете на нескольких сайтах. Однако до сих пор некоторые элементы генома не поддаются секвенированию современными технологиями, а наши знания о геноме остаются неполными. Оказалось, что лишь 30 % генома кодируют белки и участвуют в регуляции действия генов.

Каковы функции остальных участков генома и есть ли они вообще, остается совершенно неясным. Около 10 % генома составляют так называемые Alu-элементы длиной около 300 п.о. Они появились неизвестно откуда в ходе эволюции только у приматов. Попав к человеку, они размножились до полумиллиона копий и распределились по хромосомам самым причудливым образом.

Что касается кодирующих участков ДНК, то при чисто молекулярно-компьютерном анализе они были названы генами по сугубо формальным критериям: наличию знаков пунктуации, необходимых для прочтения информации и синтеза конкретного генного продукта. При этом время и действие большинства потенциальных генов пока неясны, и для определения их функций может потребоваться не меньше ста лет.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова

1. Геном, клонирование, происхождение человека. – Под ред. Л.И. Корочкина. – Фрязино: «Век 2», 2004. – 224 с.

2. Вымершие звери и птицы, которых проще всего клонировать. – Электронный ресурс. – 2013.

3. Андреева, Л.Е., В.З. Тарантул. Трансгенные животные: фундаментальные и прикладные аспекты / Л.Е. Андреева, В.З. Тарантул // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 / Отв. ред. Е.Д.Свердлов. – М.: Наука, 2003. – С. 184 – 217.

4. Клонирование человека. Вопросы этики. – Париж, Изд-во ЮНЕСКО, 2004. – 21 с.

Тема № 4. Современные методы исследования генома

Краткое содержание:

1. Классический подход к расшифровке последовательностей ДНК

2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК

3. Достижения и перспективы секвенирования

4. Использование методов биоинформатики в секвенировании

5. История прочтения генома человека

Невозможно представить себе современную биологию (не только молекулярную биологию и биохимию, но и систематику, теорию эволюции, антропологию, медицину) без мегабайтов прочитанных последовательностей ДНК, этой плоти и крови биоинформатики , самой динамично развивающейся области биологической науки. Успех в этой области был достигнут в конце ХХ в. благодаря прорыву в создании технических устройств и технологий расшифровки геномов. Определение последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК получило название секвенирования (от англ. sequence – последовательность), а приборы, предназначенные для этой цели, именуются секвенаторами .

1. Классический подход к расшифровке последовательностей днк

Самый распространенный на сегодняшний день способ секвенирования ДНК - «метод терминации цепи », или «дидезокси метод », разработанный в 70-х гг. прошлого века Фредериком Сэнгером (дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.)). Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации делает этот метод своеобразным «золотым стандартом » среди всех существующих способов определения последовательности нуклеотидных остатков ДНК. Так был расшифрован весь геном человека, и именно метод Сэнгера до сих пор является рутинным в повседневной лабораторной практике.

амплифицируются

Вначале фрагменты ДНК, последовательность которых предстоит определить, многократно копируются (амплифицируются ), затем нарезаются на короткие куски, которые служат матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК. Синтез в общих чертах напоминает процесс копирования ДНК в живой клетке.

Особенность метода заключается в использовании химически модифицированных разновидностей четырех дезоксирибонуклеотидов , составляющих цепи ДНК. Каждая разновидность «помечена» флуоресцентной молекулой-маркером, на жаргоне «краской». Короткий фрагмент ДНК, называемый затравкой, или праймером , инициирует синтез ДНК в определённой точке цепи ДНК-матрицы. Синтезирует комплементарную цепь особый фермент - ДНК-полимераза . При этом флуоресцентно меченные разновидности нуклеотидов, которые присутствуют в реакционной смеси в значительно меньших количествах, чем обычные нуклеотиды, обрывают синтез, когда один из них оказывается на конце растущей ДНК-цепи. (Все дело в том, что видоизмененные нуклеотиды не имеют той самой химической группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид для продолжения цепи.) В результате получается смесь, содержащая полный набор ново-синтезированных фрагментов ДНК, каждый из которых начинается в одном и том же месте, но заканчивается во всех возможных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы.

Современные автоматизированные секвенаторы разделяют эти фрагменты, пропуская всю смесь через тончайшие капилляры, наполненные гелем. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется в геле по капилляру под действием электрического поля. (Фрагменты ДНК - по сути, ионы, движущиеся в электрическом поле от «минуса» к «плюсу».) Процесс, называемый капиллярным электрофорезом , настолько эффективен, что фрагмент, только что вышедший из капилляра, оказывается ровно на один нуклеотид длиннее, чем предшествующий ему. По мере того как фрагмент появляется, он освещается лазером, что заставляет светиться меченый нуклеотид на его конце. Компьютер определяет разновидность этих нуклеотидов по цвету вспышки и регистрирует последовательность их появления, складывая «буквы» (нуклеотиды) в «текст» (последовательность ДНК). В случае расшифровки целого генома так нарабатываются миллиарды коротких «текстов», которые поступают в специальную программу, запускаемую на суперкомпьютерах. Программа находит места перекрывания «текстов» и, располагая их в нужном порядке, выстраивает полную последовательность генома.

Большинство новых технологических разработок направлено на миниатюризацию , мультиплексирование (в данном случае, параллельное соединение низкопроизводительных блоков системы для повышения общей производительности) и автоматизацию процесса секвенирования. Все они могут быть разделены на два класса. Первый объединяет методы «секвенирования синтезом», в которых основания определяются по мере того, как они встраиваются в растущую цепь ДНК.

Ко второму классу относятся технологии расшифровки последовательности оснований единичной молекулы ДНК. Некоторые из них достаточно экзотичны - как, например, чтение нуклеотидных остатков ДНК электронным или оптическим способом по мере того, как молекула «протискивается» через нанопору . Длинный перечень улучшений системы капиллярного электрофореза в сочетании с возрастающей автоматизацией и усовершенствованием программного обеспечения позволили снизить стоимость секвенирования в 13 раз с тех пор, как первые автоматические секвенаторы появились в 90-е годы.

Но все это выглядит несколько бледно на фоне возможностей нового метода секвенирования синтезом - изощрённого варианта пиросеквенирования, разрабатываемого и внедряемого компанией 454 Life Sciences.

2. Принцип высокопроизводительного пиросеквенирования ДНК

Технология, разработанная компанией 454 Life Sciences, называется пирофосфатным секвенированием, или пиросеквенированием . Сама идея пиросеквенирования, надо сказать, не нова: она возникла ещё в начале 90-х годов прошлого века, но опубликованный тогда метод не сумел вытеснить традиционный дидезокси метод Сэнгера. Однако разработчики из 454 Life Sciences дополнили его возможностями современных нанотехнологий, и количество перешло в качество. Поэтому, точнее будет назвать метод «пиросеквенированием ДНК в плотно упакованных пиколитровых реакторах».

Скорость является одним из главных преимуществ нового метода секвенирования. Название метода заимствовано у знаменитого на Западе автомобиля Chevrolet Chevelle SS 454 1970-го года с двигателем мощностью 360 лошадиных сил.

Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер », который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые бусинки . (Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь по одной (!) индивидуальной цепи.

Каждая бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР , эПЦР). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК, а говоря по-русски, к тому, что на поверхности бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн копий («клонов») уникальной ДНК-матрицы.

Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла » - слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор» , в котором и будет происходить реакция секвенирования.

Слайд представляет собой срез блока , полученного путём нескольких циклов вытягивания и сплавления оптических волокон. В результате каждого цикла диаметр индивидуальных волокон уменьшается по мере того, как волокна формируют пучки шестигранной упаковки увеличивающегося поперечного диаметра. Каждое волокно имеет сердечник диаметром 44 мкм, окружённый 2–3 мкм слоем оболочки. Затем сердечники вытравливаются, и в результате получаются лунки ≈55 мкм глубиной, с расстоянием ≈50 мкм между центрами соседних лунок. Объём таких «реакторов» - 75 пиколитров; плотность размещения на поверхности слайда - 480 лунок на квадратный миллиметр. Каждый слайд несёт около 1,6 миллионов лунок, в каждую из которых попадает одна (!) бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в лунки поступают необходимые реактивы.

Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, перпендикулярном оси лунок. Такая конфигурация позволяет одновременно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, внутри отдельных лунок. Добавление и удаление реагентов и продуктов реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного переноса. Время диффузии между потоком и лунками составляет около 10 секунд и зависит от высоты проточной камеры и глубины лунок. Глубина лунок тщательным образом рассчитана исходя из следующих соображений:

1. Лунки должны быть достаточно глубокими, чтобы бусинки, несущие ДНК-матрицу, не выскакивали из них под действием конвекции.

2. Они должны быть достаточно глубокими, чтобы исключить диффузию продуктов реакции из лунок, где имело место включение нуклеотида, в лунки, где включения не произошло.

3. Лунки должны быть мелкими настолько, сколько требуется для осуществления быстрой диффузии нуклеотидов в лунку и быстрого вымывания оставшихся нуклеотидов и продуктов реакции в конце каждого цикла, что, в свою очередь, необходимо для обеспечения высокой продуктивности секвенирования и снижения расходов реактивов.

Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую лунку «насыпают» ещё бусинок помельче - каждая с «сидящими» на её поверхности (иммобилизованными ) ферментами , необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд.

Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата , которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, люцифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её осуществления необходим аденозинтрифосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента - АТФ-сульфурилазы . И тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией - по-простому, маленькой вспышкой света. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge coupled device ). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраивание известного нуклеотида. Общая схема пиросеквенирования дана на рис. 1.

Связывая зарегистрированные от каждой лунки вспышки с типом нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент времени, компьютер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК в сотнях тысяч лунок одновременно. Время, необходимое для протекания ферментативной реакции, производящей детектируемую «вспышку», составляет порядка 0,02–1,5 секунд. Таким образом, скорость реакции определяется скоростью массопереноса, что оставляет место для улучшений за счёт ускорения доставки реактивов. После поступления в проточную камеру каждого нуклеотида, она промывается раствором, содержащим фермент апиразу . Таким образом, перед тем как «запустить» в камеру следующий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые нуклеотиды, остававшиеся там от предыдущего раунда.

Включение того или иного нуклеотида детектируется в результате высвобождения неорганического пирофосфата и последующего излучения света. Определить лунки, содержащие бусинки с матричной цепью ДНК, можно, прочитав «последовательность - ключ» адаптерного олигонуклеотида, пришитого к началу каждой ДНК-матрицы. Из регистрируемого сигнала вычитается уровень фона, затем сигнал нормализуется и корректируется.

Интенсивность нормализованного сигнала для каждой конкретной лунки во время поступления в проточную камеру определённого нуклеотида пропорциональна числу встроенных нуклеотидов. Линейность зависимости сохраняется для гомополимеров длиной как минимум в восемь нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом очень небольшое число ДНК-матриц на каждой бусинке теряет синхронизм , т. е. вырываются вперёд или начинают отставать от других матриц. Исправление таких сдвигов необходимо, поскольку потеря синхронизма создаёт кумулятивный эффект , сильно снижающий качество прочтения при увеличении его длины. С учетом этого, сотрудники компании 454 разработали особый алгоритм, позволяющий оценивать и вносить поправки на «перелёт» и неполную достройку цепи, происходящие в отдельных лунках. Высокая точность расшифровки последовательности достигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того же фрагмента, что позволяет построить единую обобщённую (так называемую консенсусную ) последовательность.

Отдельные прочтения (риды – от англ. reаd, читать) одного и того же участка ДНК выравниваются относительно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через камеру того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений. Затем соответствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную последовательность. Такой подход значительно улучшает качество расшифровки последовательности и предоставляет возможность оценки её качества.

В 2005 г. учёные из 454 Life Sciences, используя свою технологию, сумели расшифровать состоящий из 600 тысяч нуклеотидов геном бактерии Mycoplasma genitalium с точностью 99,4%, а также состоящий из 2,1 млн нуклеотидов геном Streptococcus pneumoniae .

Рисунок 1 - Схема пиросеквенирования. А - ДНК фрагментируется, к фрагментам пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры»; полученные двуцепочечные молекулы ДНК разделяются на две комплементарные цепи. Б - Одноцепочечные молекулы ДНК прикрепляются к бусинкам в условиях, стимулирующих попадание лишь одной молекулы на бусинку. Отдельные бусинки заключаются в капли реакционной смеси, окруженные маслом. Количество молекул на бусинке увеличивается в миллионы раз в результате эмульсионной полимеразной цепной реакции (эПЦР). В - Эмульсия разбивается, и цепи ДНК-фрагментов, образовавшиеся в результате эПЦР, разделяются. Бусинки, несущие на своей поверхности миллионы одноцепочечных копий первоначального фрагмента ДНК, помещаются в лунки оптико-волоконного слайда, по одной в каждую лунку. Г - В каждую лунку добавляются бусинки поменьше, несущие на своей поверхности ферменты, необходимые для пиросеквенирования. Д - Микрофотография эмульсии, изображающая «пустые» капли и капли, содержащие бусинки с ДНК-матрицей. Толстая стрелка указывает на 100-мкм каплю, тонкая - на 28-мкм бусинку. Е - Микрофотография фрагмента оптико-волоконного слайда, полученная при помощи сканирующего электронного микроскопа. Видны оболочки оптических волокон и пустые лунки

В статье, в которой впервые был представлен и опробован новый метод, сообщается, что весь геном Mycoplasma genitalium был прочтён за один раз! Сначала весь геном был фрагментирован и превращён в библиотеку кусочков ДНК, как описано выше (труд одного человека на протяжении 4-х часов). После проведения эмульсионной ПЦР и помещения полученных бусинок с ДНК-матрицами на 60 мм 2 слайд (на что одному сотруднику потребовалось 6 часов), процесс завершился 4-х часовой автоматической работой инструмента, состоящей из 42 циклов.

В результате сборки прочитанных последовательностей (каждый около 108 пар оснований) было получено 25 отдельных непрерывных фрагментов, так называемых контигов (от англ. contigious –соприкасающийся), средней длиной в 22,4 тысяч пар оснований. Эти фрагменты покрыли около 96,54% всего генома микоплазмы. Из оставшихся непрочтёнными 4,6% генома, 3% приходились на неразрешимые повторы . Таким образом, за один раз было отсеквенировано 99,5% уникальной последовательности генома.

3. Достижения и перспективы секвенирования

Хотя первая версия инструмента от компании 454 Life Sciences легко могла заменить более 50 капиллярных секвенаторов Applied Biosystem 3730XL по цене в шесть раз меньшей, реакция научного сообщества была на удивление прохладной. Вместо того чтобы принять новую технологию и начать использовать её неисчерпаемый потенциал, многие учёные, привыкшие к использованию метода Сэнгера, заговорили о таких проблемах, как точность расшифровки, длина отдельных прочтений, стоимость инфраструктуры... А кто-то просто восставал против необходимости работать с большими массивами информации, производимыми с использованием новой технологии.

Большинство критиков, однако, не заметили, что множество препятствий, стоящих на пути метода секвенирования следующего поколения, преграждали на первых порах путь и методу Сэнгера. Тогда длина прочтений составляла всего 25 пар оснований, и достигла 80 только после появления терминирующих дидезокси-нуклеотидов Фреда Сэнгера. Технология «секвенирования синтезом», основанная на выделении пирофосфата, изначально позволяла прочитывать отрезки длиной не более 100 нуклеотидов. Спустя 16 месяцев на биотехнологическом рынке, этот показатель был улучшен до 250 пар оснований. Последние разработки позволяют считывать уже около 500 пар оснований, приближая новый метод к методу Сэнгера с его ≈1000 нуклеотидами.

Другим важным фактором, помимо длины отдельных прочтений, является число прочтений , производимое в результате одного «прогона » секвенатора, нормированное на стоимость такого «прогона». Этот вопрос хорошо решается конкурентами 454 Life Sciences, системы которых производят в десять раз больше прочтений, платя за это укорочением их длины, составляющей всего 35 (или меньше) нуклеотидов. Сегодня на рынке существует три коммерческих системы нового поколения для секвенирования ДНК:

Roche (454) GS FLX Genome Analyzer, распространяемый Roche Applied Sciences. (Компания 454 LIfe Sciences выкуплена гигантом Roche Diagnostics в марте 2007 г. за 154,9 млн. долларов, но продолжает оставаться независимым подразделением);

Секвенатор Illumina Solexa 1G и

Наиболее свежая система SOLiD от Applied Biosystems.

Другие системы для расшифровки ДНК, которые уже появились на рынке, относятся к «третьему поколению » и основываются на анализе одиночных молекул. Они разрабатывались компаниями VisiGen и Helicos.

И хотя прочтение бактериального генома за раз было впечатляющим достижением, поначалу не было ясно, какие биологические задачи , недоступные старому доброму методу Сэнгера, можно будет решать, взяв на вооружение новый метод пиросеквенирования. И действительно, первые проекты с участием инструмента Roche 454 GS20 заключались лишь в «перечитывании» уже расшифрованных бактериальных геномов и подкреплении дополнительными данными уже идущих больших «Сэнгеровских проектов». В то же время исследования в области метагеномики , помимо работы с огромными массивами данных, порою бóльшими, чем геном человека, страдали от искажений, вносимых на стадиях конструирования библиотек и клонирования фрагментов для секвенирования.

В этом смысле технология 454, сочетающая эПЦР и пиросеквенирование, обладает неоспоримым преимуществом перед методом Сэнгера. Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать без всяких предпочтений единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку эмульсии и устраняя конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число ДНК-полимераз. Пиросеквенирование, в свою очередь, осуществляет параллельное прочтение этих матриц со световым сигналом на выходе, который может считываться компьютером. Первые подобные исследования, опубликованные в 2006 году, показали необыкновенную гибкость метода нового поколения, использованного при изучении микробного многообразия подземных экосистем глубокой шахты, глубоководных морских экосистем, морских вирусных «сообществ» («виромов ») в нескольких океанах.

Интересное исследование, сочетающее в себе метагеномный анализ и «ДНК-палеонтологию », было проведено в конце 2005 г. Одного запуска инструмента Roche (454) GS20 было достаточно для анализа 13 млн. пар оснований последовательности генома 28 000-летнего мамонта . Эта работа проложила дорогу для технически более трудного проекта расшифровки генома неандертальца . Трудность такого проекта состоит в том, что количество выделяемой из образцов костей древней ДНК неандертальца составляет всего лишь 5% от количества, получаемого из «свежего материала». Следовательно, секвенировать приходится в 20 раз дольше, чем это необходимо для генома современного человека. Кроме того, вклад разрушения ДНК в образцах, сохраняемых при умеренных температурах, в сочетании с ошибками, присущими новому методу пиросеквенирования, часто превосходит уровень различия, установленный для геномов неандертальца и современного человека. Поэтому утверждать, что полученная последовательность действительно древняя, а не случайно попавшая в препарат современная ДНК, значительно легче в случае с мамонтом - современные слоны, в отличие от людей, не часто встречаются в лабораториях. Для того чтобы получить настоящую последовательность древнего генома млекопитающего, необходимо провести множество раундов прочтения каждого участка генома, а также удостовериться в происхождении прочитанных участков.

Вместе с прорывом в области секвенирования сложных смесей ДНК, такие проекты сделают возможным изучение любой экосистемы на планете на уровне последовательностей ДНК. Это откроет доступ к флоре и фауне 100-тысячелетней давности - возможности, превосходящие самые смелые ожидания совсем недалекого прошлого.

На клеточном уровне секвенирование нового поколения (здесь и далее речь идёт не только о пиросеквенировании, но и о других новых методах секвенирования синтезом) впервые позволяет учёным идентифицировать мутации в любом организме для всего генома. Так были найдены аллели, отвечающие за устойчивость к антибиотику у Mycobacterium tuberculosis , а также идентифицированы все мутации в геноме размером в 9 млн пар оснований у штамма бактерии, эволюционировавшей на протяжении 1000 поколений. Эти ранние попытки не только продемонстрировали способность новой технологии обнаруживать мутации и ошибки в опубликованных научных статьях, но и связанные с её использованием трудности, такие как ошибки прочтения гомополимерных последовательностей при пиросеквенировании (454) или быстрое уменьшение качества прочтения ближе к 3’-концу последовательности в системах с короткой длиной индивидуальных прочтений (Solexa или SOLiD от Applied Biosystem).

Раньше для преодоления этих трудностей данные, полученные пиросеквенированием, дополняли информацией, полученной классическим сэнгеровским путём. Но поскольку стоимость и затраты, требуемые сэнгеровской составляющей эксперимента, остаются отталкивающе высокими, многие лаборатории сегодня полагаются только на методы нового поколения, обычно сочетая относительно длинные прочтения пиросеквенирования с короткими, но дешевыми (а значит, и многочисленными) прочтениями, осуществляемыми системами Solexa и SOLiD. Такое сочетание различных платформ позволяет производить независимую оценку качества их работы, а также проверять эталонные последовательности, хранящиеся в общественных базах данных.

Получение большого количества последовательностей ДНК из различных близкородственных организмов движет вперед и развивает подход, названный повторным секвенированием (resequencing), в котором работа с последовательностями ведётся иначе, чем при сборке свежесеквенированного генома. При повторном секвенировании сборка направляется уже имеющейся под рукой эталонной последовательностью, и поэтому требует значительно меньшего покрытия (8–12-ти кратного), чем при сборке генома de novo (25–70-ти кратного). Этот подход был применён в работе по расшифровке 10 митохондриальных геномов млекопитающих, которая сделала возможными исследования в области генетики популяций, основанные не на коротких отрезках последовательности, а на полных геномах митохондрий. В настоящий момент многочисленные проекты по расшифровке микробных геномов ведутся не только для расширения списка доступных геномов, но и для проведения будущих сравнительных исследований, сопоставляющих генотип и фенотип организма на геномном уровне.

Далеко может продвинуться также и работа по изучению организмов, которые не стоят в планах по геномному секвенированию - благодаря возможностям новых методов секвенирования напрямую расшифровывать последовательности транскриптов (точнее, кДНК - ДНК-копий матричных РНК) в клетке. Изучение транскриптов посредством прямого секвенирования обладает рядом преимуществ перед методом гибридизации на ДНК-микрочипах. Главное здесь то, что секвенирование не требует никаких знаний о геномной последовательности организма a priori , поскольку последовательность транскрипта может быть немедленно сравнена с эталонной последовательностью близкородственного вида из базы данных, используя стандартные алгоритмы биоинформатики. Знание последовательностей транскриптов может в корне изменить исследования организмов, геномы которых сегодня не стоят в очереди на расшифровку, а в некоторых случаях никогда там и не окажутся. Первые работы в этой области показали, что существует возможность сопоставлять последовательности (кДНК и геномные, соответственно) двух таких далёких друг от друга видов, как бобовое Meticago truncatula и растение-эталон Arabidopsis thaliana . Также было обнаружено множество не описанных ранее транскриптов кукурузы Zea mays .

Прямой анализ транскриптов поможет обойти проблему, которую ставят перед учёными организмы с непомерно большими геномами. Несмотря на успешно проведённые проекты по расшифровке вирусных, бактериальных и больших геномов млекопитающих, метод Сэнгера оставил задачу по расшифровке геномов полиплоидных растений своим преемникам. Эти гигантские геномы, частенько принадлежащие важным хозяйственным растениям (например, геном пшеницы составляет 16 млрд пар оснований), делали все предыдущие попытки по расшифровке бесплодными. Однако перспектива дешёвого секвенирования экспрессируемых участков генома (то есть транскриптов) позволяет надеяться на успешное изучение геномов таких растений хотя бы на функциональном уровне.

И наконец, новые методы секвенирования имеют практическое применение и в медицине. Например, в генетике раковых заболеваний, специфические раковые аллели могут быть отслежены в тканях посредством высокопроизводительного секвенирования геномной ДНК в тех случаях, когда метод Сэнгера терпит поражение. И здесь большим преимуществом нового метода оборачивается многократное прочтение последовательности.

Несмотря на то, что новые методы секвенирования ДНК уже стимулировали большое количество всевозможных исследований, осуществление которых было невозможно ещё в недалёком прошлом, учёным и инженерам, занимающимися разработкой этих технологий - а равно как и компаниям, продвигающим эти технологии на рынке, - предстоит многое сделать для её улучшения. Прежде всего, снизить стоимость . Уменьшение цены на один-два порядка необходимо для осуществления надежд на персональную геномику , цель которой - повторное секвенирование индивидуальных геномов по цене, не превышающей 1000 долларов. В дополнение к этому, снижение процента ошибок будет также горячо приветствоваться - не только для методов следующего поколения, но и для метода Сэнгера, который будет продолжать вносить вклад и в обозримом будущем. Возможно, появятся искусственно изменённые специализированные ДНК -полимеразы , предоставляющие информацию о последовательности ДНК в виде испускаемого светового сигнала. По мере того, как стоимость технологий будет снижаться, количество накапливаемой информации будет расти лавинообразно, что может создать «узкое место» в исследованиях. Поэтому часть усилий по разработке новых технологий секвенирования необходимо направить на развитие биоинформатики .

Геном человека

Расшифровка генома человека – событие столь же важное в истории человечества, как открытие электричества, изобретение радио или создание компьютеров.

Немного истории. В 1988 году Национальный институт здоровья США начал проект «Геном человека» , возглавил который нобелевский лауреат Джеймс Уотсон . Основная цель проекта – выяснить последовательность нуклеотидных оснований во всех молекулах ДНК человека и установить локализацию, т.е. полностью картировать все гены человека.

Планировалось, что работа но определению нуклеотидной последовательности ДНК человека (секвенирование ДНК ) должна окончиться в 2005-м году . Однако после первого года работы стало ясно, что скорости секвениронания ДНК очень низкие и для полного завершения работы такими темпами потребуется около 100 лет .

Стало очевидно, что необходим поиск новых технологий секвенирования, создание новой вычислительной техники и оригинальных компьютерных программ. Это было невыполнимо в рамках отдельно взятого государства , и к программе подключились другие страны.

Широкомасштабные координированные исследования стали проводиться под эгидой международной организации ^ Human Genom Organisation (HUGO). С 1989 г. в проект включилась и Россия. Все хромосомы человека были поделены между странами-участницами, и России для исследования достались 3-, 13- и 19-я хромосомы . В проекте оказались задействованы несколько тысяч ученых из 20 стран .

В 1996 были созданы всемирные банки данных по ДНК человека. Любая вновь определенная последовательность нуклеотидов размером более 1 тыс. оснований должна была быть обнародована через Интернет в течение суток после ее расшифровки, в противном случае статьи с этими данными в научные журналы не принимались. Любой специалист в мире мог воспользоваться этой информацией.

К началу 1998 г. было секвенировано всего около ^ 3% генома . В это время к работе неожиданно подключилась частная американская компания из штата Мериленд «Celera Genomics» под руководством Крега Вентера , которая объявила, что закончит свою работу на 4 года раньше международного консорциума.

Началась беспримерная в науке гонка. Два коллектива работали независимо, не жалея сил, чтобы придти к финишу первыми. В ходе выполнения проекта «Геном человека» было разработано много новых методов исследования, большинство из которых значительно ускоряет и удешевляет работу по расшифровке ДНК. Эти методы анализа сейчас используются в медицине, криминалистике и т.д.

В июне 2000 года два конкурирующих коллектива объединили свои данные, официально объявив о завершении работ. А в феврале 2001 года появились научные публикации чернового варианта структуры генома человека. Качество секвенирования достаточно высокое и предполагает всего 1 ошибку на 50 тыс.п.н .

«Геном человека» вошел в историю как один из самых трудоемких и дорогостоящих проектов. На него было потрачено в сумме более ^ 6 миллиардов долларов.

Возникает естественный вопрос: геном какого же человека определен в результате этих титанических усилий, кто этот конкретный человек? Согласно имеющимся данным, фирма Celera в основном ориентировалась на геном одного человека, о котором известно лишь, что это белый мужчина среднего возраста. Скорее всего, это был сам глава корпорации Крег Вентер. Международный консорциум использовал в своей работе материал не менее семи различных людей.

Геном человека состоит из 24 хромосом и 3,2 млрд. п.н. Хромосомы человека были пронумерованы согласно размеру : наибольший - у хромосомы 1, наименьший - у хромосомы 22. Со временем выяснилось, что хромосома 22 содержит больше ДНК, чем хромосома 21, но порядок нумерации не стали менять, чтобы не вносить путаницу. Отдельно идут две половые хромосомы: X и Y (условно их можно назвать томами № 23 и № 24 Энциклопедии человеческого генома).

^ В геноме женщин содержится лишь 23 хромосомы из 24-х , и все они представлены в соматических клетках двумя экземплярами. У мужчин в клетках содержится полная Энциклопедия человека, все 24 хромосомы, но две из них (хромосомы X и Y) существуют в единичных экземплярах.

Разные хромосомы сильно отличаются друг от друга по числу и свойствам генов (в первой, самой большой, хромосоме содержится 263 млн. п.н., составляющих 2237 гена, а в 21 хромосоме – 50 млн.п.н. и 82 гена). www . ensembl . org

Также отличаются хромосомы и по важности записанной в них информации. Число генов, ассоциируемых с различными болезнями больше всего в Х хромосоме – 208; в 1 хмс – 157; и в 11 хмс – 135. Меньше всего таких генов в Y хмс – всего 3. Тем не менее, только совокупность всех хромосом обеспечивает клетки полной информацией, позволяющей человеку нормально развиваться и жить. В отсутствие любой из пар хромосом жизнь конкретного индивидуума становится невозможной.

При потере по каким-либо причинам только одной из пары хромосом состояние человека сильно отличается от нормы. Например, частичная моносомия 5-ой хромосомы приводит к синдрому кошачьего крика . У детей с этой аномалией отмечается необычный плач, что обусловлено изменением гортани, а также черепа и лица.

В клетках человека также имеется ДНК , расположенная не в хромосомах, а в митохонд-риях. Это тоже часть генома человека, называемая М-хромосомой . В отличие от ядерного генома митохондриальные гены располагаются компактно, как в геноме бактерий, и имеют свой собственный генетический код (своеобразный «генетический жаргон»). МитДНК ответственна в клетке за синтез всего лишь нескольких белков. Но эти белки очень важны для клетки, поскольку участвуют в обеспечении клетки энергией.

Предполагают, что митохондрии появились в клетках эукариот в результате симбиоза высших организмов с аэробными бактериями.

МитДНК передается из поколения в поколение только по женской линии . При оплодотворении в яйцо проникает сперматозоид с набором отцовских хромосом, но без отцовских митохондрий. Только яйцеклетка предоставляет зароды-шу свою митДНК. Поэтому митДНК удобно использовать для определения степени родства как внутри вида, так и между различными таксонами.

Одной из целей исследования генома человека являлось построение точной и подробной карты всех хромосом. Генетическая карта представляет собой схему, описывающую порядок расположения на хромосоме генов и других генетических элементов. (снипсы-повторы-гены ).

В кодировании белков принимает участие не более 1,5 % хромосомной ДНК человека (т.е. генетические инструкции по формированию человеческого индивидуума занимают лишь 3 см на двухметровой молекуле ДНК человека ).

Анализ генома человека позволил выявить у него порядка ^ 40 тыс . генов (на сегодня). Самые короткие гены содержат всего 20 п.н. (гены эндорфинов , вызывающих ощущение удовольствия). Самый длинный ген, кодирующий один из белков мышц (миодистрофин), содержит порядка 2,5 млн. п.н.

^ Плотность расположения генов в хромосомах сильно различается. Средняя плотности составляет около 10 генов на 1 млн.п.н. Однако в хромосоме 19 плотность составляет 20 генов , а в Y-хромосоме - всего 1,5 гена на млн. Если сравнить плотность генов с плотностью расселения людей, то Y-хромосома напоминает нашу Сибирь, а хромосома 19 - Европейскую часть России. Плотность расположения генов падает по мере эволюционного усложнения организмов. Для сравнения: в геноме бактерий содержится свыше 1000 генов на 1,0 млн. и. н., у дрожжей около 450 генов на 1,0 млн. п. н., а у червя С. elegans - около 200 .

Как у людей имеются семьи, так и гены объединяют в семейства по их схожести. В геноме человека присутствуют около 1,5 тыс. таких семейств. Причем только около сотни из них специфичны для человека и позвоночных животных. Основная же масса генных семейств имеется как у человека, так и у дождевого червя.

Разные гены одного семейства возникали в ходе эволюции из одного гена-предшественника как следствие мутаций. «Родственные» гены чаще всего выполняют сходную функцию. Например, геном человека имеет около 1 000 генов-рецепторов обоняния.

В семействах генов иногда встречаются псевдогены . Это гены, утратившие способность к экспрессии. Перед их названием ставят греческую букву . He совсем ясно, зачем геному нужны такие гены, почему он сохранил их в эволюции и не избавился от них. В геноме человека имеется около 20 000 таких псевдогенов . В частности, в огромной семействе генов обоняния около 60% являются псевдогенами. Считается, что массивная потеря функциональных генов произошла за последние 10 млн. лет в связи со снижением роли обоняния у человека по сравнению с другими млекопитающими.

Около 20 % генов человека функционируют во всех типах клеток человека. Остальные же гены работают только в определенных тканях и органах. Например, глобиновые гены экспрессируются только в клетках крови, поскольку основная их функция – обеспечивать перенос кислорода.

Примером высочайшей специализации генов служат обонятельные гены . В каждой клетке органа обоняния человека – обонятельной луковице - работает только 1 ген из 1000 возможных. Сильнейшее недоумение ученых вызвал тот факт, что некоторые из этих генов, кроме обонятельной луковицы, активизируются еще в одном типе клеток – сперматозоидах . Как это связано с восприятием запаха, пока не совсем ясно.

Картирование хромосом также позволило выявить локализацию участков, отвечающих за некоторые болезни человека.

Например, в первой хромосоме гены связанны с раком протоков молочной железы. Во второй – с ожирением. В третьей – с шизофренией. В четвертой хромосоме обнаружен ген, мутации которого приводят к развитию алкоголизма. Мутации в концевом участке Х -хромосомы вызывают предрасположенность к гомосекесуализму.

Внимание специалистов также привлекли гены, связанные с некоторыми особенностями поведения человека . Эти гены кодируют белки, участвующие в передаче сигналов между нервными клетками (например, белок серотонин). Ген, кодирующий рецептор серотонина, ученые назвали «геном самоубийства». Мутации по этому гену вызывают у людей склонностью к отрицательным эмоциям и суицидные наклонности.

Другой передатчик сигналов в нервной системе - дофамин – вещество, играющего ключевую роль в работе центров удовольствия мозга. Избыток дофамина вызывает у животных исследовательскую гиперактивность.. Было обнаружено, что один из генов, кодирующих белки-рецепторы дофамина, может существовать в разных аллельных формах (длинной и короткой). Люди с длинной аллелью больше склонны к поиску новых впечатлений, поэтому обнаруженный ген так и назвали «геном поиска новизны». У американцев длинная аллель гена рецептора дофамина встречается в 25 раз чаще, чем, скажем, у жителей Южной и Восточной Азии. Из истории мы знаем, как заселялась Америка европейцами. В первую очередь, это были энергичные люди, склонные к авантюризму, любопытные и импульсивные. Вот они то и внесли длинную аллель «гена поиска новизны» в современную американскую популяцию.

Недавно обнаружены два гена, которые отвечают за материнские инстинкты (эти гены так и были названы генами «материнского инстинкта» ). При этом, ко всеобщему удивлению, выяснилось, что оба гена дочки получают от отцов. Животные, у которых гены «материнского инстинкта» отсутствовали, не заботились о новорожденных.

Необходимо подчеркнуть, что, в отличие от генов, ответственных за физические параметры, наличие «больных» генов, формирующих психику и поведение, еще не означает стопроцентную обреченность человека па определенные отрицательные проявления. Во-первых, как правило, не один, а совокупность генов отвечает за душевные характеристики. Между ними существует очень сложное и порой весьма неоднозначное взаимодействие, эффект которого зависит от множества различных факторов. Во-вторых, как считает большинство ученых, психика и поведение человека лишь процентов на 50 определяются генами .

Одним из методов изучения влияния окружающей среды на проявление генотипа является наблюдение за однояйцовыми близнецами. Такой подход в генетике получил название «близнецовый метод ».

Однояйцовые близнецы образуются в результате деления одной и той же зиготы и содержат идентичные геномы. Хотя появление близнецов - довольно редкое явление (считается, что у человека одна двойня приходится па 80-85 родов), тем не менее, имеющихся случаев достаточно для проведения соответствующих исследований.

Одним из наиболее четких способов идентификации человека являются отпечатки пальцев . Характерные «узоры» закладываются у зародыша уже на третьем месяце развития и сохраняются без изменения в течение всей жизни. При сравнении кожных «узоров» у близнецов было выявлено, что они очень похожи, но, что удивительно, не всегда полностью идентичны.

При исследовании ряда других признаков также наблюдали их небольшие вариации у близнецов: цвет глаз и волос, форма уха.

Крупномасштабное сравнение однояйцовых близнецов друг с другом показало, что возникновение таких инфекционных заболеваний , как корь, коклюш, ветряная оспа практически полностью зависит от возбудителя заболевания, а вот полиомиелит и туберкулез определяются кроме того наследственными свойствами человека. В частности, заболеваемость туберкулезом обоих однояйцовых близнецов более чем в 3 раза выше, чем у двух разнояйцовых близнецов.

Исследование близнецов, проведенное в Каролинском институте в Стокгольме, убедительно показало существенное воздействие факторов окружающей среды (курения, загрязнений, питания, образа жизни) на развитие некоторых форм злокачественных заболеваний. Вместе с тем отмечено влияние генетических факторов на возникновение рака простаты, рака прямой кишки и рака груди.

При анализе близнецов удалось выяснить, что умственное развитие также могут объясняться генетически. Если один из пары однояйцовых близнецов слабоумен, то второй оказывается таким же почти всегда.

Российскими учеными было проведено исследование детей-близнецов в возрасте от 7 до 12 месяцев на предмет того, в какой мере генетика и среда влияют на агрессивность, раздражительность, активность и общительность . Оказалось, что первые три черты темперамента находятся под жестким генетическим контролем: агрессивность поведения младенца:на 94 процента определяется его генотипом, активность - па 89 процентов, раздражительность - па 85 процентов. А общительность почти на 90% формируется под влиянием среды, которую создают родители.

Благодаря методу близнецового анализа на генетический уровень вышла и широко обсуждаемая проблема гомосексуализма . Уже имеются достоверные данные, что около 57% однояйцовых близнецов, братьев мужчин-гомосексуалов также являются гомосексуалами. Для женщин-лесбиянок эта цифра составляет приблизительно 50%.

Осознание гомосексуализма как наследственной болезни возможно поможет решить как проблему гомофобии (плохо ненавидеть больных людей), так и проблему агрессивного гомосексуализма (эти люди требуют признания их здоровыми и полноценными, порой даже гордятся своей особенностью). Однако, если рассматривать гомосексуализм как болезнь, как патологию, ситуация кардинально меняется. Трудно представить себе человека, гордо стоящего с плакатом: «Я страдаю шизофренией, поэтому требую к себе уважения, как к полноценному члену общества!».

Согласно современным оценкам, продолжительность жизни человека, также связана с генетическими факторами, роль которых оценивается на уровне 65-70%.

Многочисленные и разнообразные данные позволяют утверждать, что геном определяет многое в нас, но и окружающая среда весьма заметно вмешивается в нашу сущность. Взаимосвязь между генами и окружающей средой ученые иногда сравнивают с заряженным пистолетом и курком. Пистолет не выстрелит, пока не будет нажат курок. Также обстоит ситуация и в клетке, где в качестве заряженного пистолета служит ген, а функцию курка выполняют всевозможные факторы окружающей среды. Имеется и другое сравнение - с карточной игрой: хороший игрок может выиграть и с плохими картами.

Чтобы разобраться в тех многочисленных взаимосвязях, которые существуют между проявлением отдельных вариантов генов и влиянием па этот процесс различных факторов окружающей среды, был создан специальный международный проект - The Environmental Genome Project. Среди множества задач данного проекта главной является, конечно же, изучение влияния окружающей среды па продолжительность жизни, а также на возникновение и развитие различных заболевании человека. В конечном итоге этот проект может оказаться не менее важным и сложным, чем знаменитый и очень дорогостоящий проект по секвенированию генома человека. А в том, что он будет продолжаться по времени значительно дольше, чем геномный проект, нет никакого сомнения.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДНК

1. Для выделения ДНК из гомогената тканей уда­ляют фрагменты клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования. Белки, разрушенные
протеазами (чаще всего применяют протеиназу К), экстрагируют из раствора. Затем ДНК осаждают, на­пример, этанолом и после удаления надосадочной
жидкости ДНК растворяют в буферном растворе.

2. Молекула ДНК среднего размера содержит 150 000 000 нуклеотидных пар и имеет длину 4 см.
Поэтому молекулы ДНК чувствительны к сдвиго­вым усилиям, возникающим в растворе, и в процессе выделения ДНК из тканей она фрагменти-руется. Получаются молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно очень большие - тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их при­ходится дополнительно фрагментировать.

Для фрагментирования используют рестриктазы - ферменты, выделяемые из бактерий. У бак­терий эти ферменты участвуют в уничтожении чужеродных для них ДНК. Рестриктазы «узнают» специфические последовательности из 4-6 нук­леотидов (сайты рестрикции), которые встреча­ются в ДНК человека. Известно множество раз­личных рестриктаз, причем каждая из них «узнает» свой сайт рестрикции (рис. 3.3).

С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. На­пример, для изучения первичной структуры удобны фрагменты размером около 300 нуклеотидных пар н.п. Следовательно, цельную молекулу ДНК в 150 000 000 н.п. нужно разрезать на 500 000 фраг­ментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для прове­дения некоторых исследований необходимо боль­шое количество хорошо очищенной высокомоле­кулярной ДНК. Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие уча­стки ДНК и получить за 3-4 ч несколько миллио­нов копий исследуемого фрагмента. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды и т.д. Подробно этот метод и его применение в ДНК-диагностике будут рассмотрены в теме 3.10.

Гибридизация. Для изучения видовой специфично­сти нуклеиновых кислот применяют метод гибриди­зации. Он основан на способности ДНК к денатура­ции при нагревании (80-90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использова­ние метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Методом гибридизации можно установить сход­ство и различия первичной структуры разных об­разцов нуклеиновых кислот.

Секвенирование генома.

Секвенирование генома здорового человека в большинстве случаев не способно предсказать развитие у него в будущем тех или иных заболеваний. Результаты этой работы были представлены на Ежегодной встрече Американской Ассоциации по исследованию рака (Association for Cancer Research), а также опубликованы в журнале Science Translational Medicine .

Полное секвенирование генома представляет собой «каталогизирование» всех генов, полученных человеком от обоих родителей, и их проверку на наличие повреждений ДНК, которые могли бы повысить восприимчивость человека к раку и иным заболеваниям. Поскольку стоимость секвенирования генома постоянно снижается (в настоящее время цена процедуры составляет 1-3 тысячи долларов США), многие здоровые люди начали задумываться над тем, чтобы пройти такое обследование и определить для себя риск развития того или иного заболевания. Однако исследователи из Центра по изучению рака Johns Hopkins Kimmel призывают их не торопиться.

Выводы ученых вовсе не означают, что секвенирование генома не имеет никакой медицинской ценности. «Во-первых, секвенирование генома остается лучшим средством для предсказания „семейных“ заболеваний, таких как рак и некоторые другие, - говорит профессор онкологии Берт Фогельштайн (Bert Vogelstein). - Во-вторых, детальное изучение генома индивидуума помогает лучше понять механизм уже протекающего у него заболевания и точнее подобрать для него индивидуальную терапию. Однако в случае со здоровым человеком геном перестает быть надежным предсказателем».

Исследователи проследили развитие 24 заболеваний у более чем 50 тысяч близнецов из 5 стран, прошедших процедуру секвенирования генома. Результаты показали, что в случае 23 заболеваний анализ генома дал отрицательный результат и отнес риск их развития к разряду «низкий». Однако, по словам профессора Фогельштайна, это вовсе не означает, что данное заболевание у данного человека не разовьется. «Это означает всего лишь, что его персональный риск немного ниже, чем средний риск по популяции, который может быть очень существенным, - говорит исследователь. - Таким образом, даже негативный результат не гарантирует отсутствия заболевания в будущем». При этом риск 4 из 24 заболеваний- заболевания сердца у мужчин, аутоиммунный тиреоидит, диабет I типа и болезнь Альцгеймера - устойчиво определялся в ¾ случаев, что позволяет назвать секвенирование генома достаточно надежным средством определения предрасположенности к этим болезням.

Современная геномика.

Длительное время геномом называли гаплоидный набор хромосом. Накопление сведений об информационной роли внехромосомной ДНК изменило определение термина «геном». В настоящее время он означает полный состав ДНК клетки, т.е. совокупность всех генов и межгенных участков. Можно считать, что геном - полный набор инструкций для формирования и функционирования индивида.

Общие принципы построения геномов и их структурно-функциональную организацию изучает геномика, которая проводит секвенирование, картирование и идентификацию функций генов и внегенных элементов. Методы геномики направлены на расшифровку новых закономерностей биологических систем и процессов. Геномика человека является основой молекулярной медицины и имеет важнейшее значение для разработки методов диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных болезней. Для медицины первостепенное значение имеют исследования в области геномики патогенных микроорганизмов, поскольку они проливают свет на природу инфекционного процесса и создание лекарств, направленных на специфические мишени бактерий.

Геномика, несмотря на её «молодой возраст», подразделяется на несколько почти самостоятельных направлений: структурную, функциональную, сравнительную, эволюционную, медицинскую геномику.

Структурная геномика изучает последовательность нуклеотидов в геномах, определяет границы и строение генов, межгенных участков и других структурных генетических элементов (промоторов, энхансеров и т.д.), т.е. составляет генетические, физические и транскриптные карты организма.

Функциональная геномика. Исследования в области функциональной гено-мики направлены на идентификацию функций каждого гена и участка генома, их взаимодействие в клеточной системе. Очевидно, это будет осуществляться путём изучения белковых ансамблей в разных клетках. Эту область исследований называют протеомикой.

Сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования.

Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального переноса генов. Эволюционный подход к изучению генома человека позволяет проследить за длительностью формирования комплексов генов, отдельных хромосом, стабильностью его частей, недавно обнаруженными элементами «непостоянства» генома, процессом расообразования, эволюцией наследственной патологии.

Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов (например, диагностика наследственных болезней, генотерапия, причины вирулентности болезнетворных микроорганизмов и т.д.).

Все шаги эволюции живой природы, несомненно, должны были закрепляться в информационной системе ДНК (а для некоторых существ - в РНК), а также в организации её в клетке для выполнения консервативной функции сохранения наследственности и противоположной функции - поддержания изменчивости. Такое представление о формировании генома каждого вида наиболее обоснованно. Применительно к геному человека можно сказать, что эволюция человека - это эволюция генома. Такое представление подтверждается теперь многочисленными молекулярно-генетическими исследованиями, поскольку стало возможным сопоставление геномов разных видов млекопитающих, в том числе человекообразных обезьян, а также в пределах вида Homo sapiens геномов разных рас, этносов, популяций человека и отдельных индивидов.

Организация генома каждого эукариотического вида представляет собой последовательную иерархию элементов: нуклеотидов, кодонов, доменов, генов с межгенными участками, сложных генов, плеч хромосом, хромосом, гаплоидного набора вместе с внехромосомной и внеядерной ДНК. В эволюционном преобразовании генома каждый из этих иерархических уровней мог вести себя совершенно дискретно (изменяясь, комбинируясь с другими и т.д.).

Наши представления о геноме человека - обширная область генетики человека, включающая по меньшей мере понятия «инвентаризации» генов, групп сцепления, картирования генов (локализация), секвенирования всей ДНК (генов, их мутаций и хромосом в целом), мейотических преобразований, функционирования отдельных генов и их взаимодействий, интеграции структуры и функции генома в целом. На решении всех этих вопросов была сосредоточена обширная многолетняя международная программа «Геном человека» (с 1990 по 2000 г.). Главным направлением работ были последовательное секвенирование участков генома и их «состыковка». Успешные разработки в этой области придали программе клинико-генетический аспект.

Клинические приложения сведений о геноме человека

Систематическое изучение генома человека фактически началось с применения менделевского анализа наследственных признаков человека (начало XX века). Генеалогический метод вошел тогда в широкую практику, и шаг за шагом стал накапливаться материал по «инвентаризации» дискретных наследственных признаков человека, но этот процесс постепенно замедлялся (за 50 лет было открыто не более 400 менделирующих признаков и 4 группы сцепления), возможности клинико-генеалогического метода в чистом виде были исчерпаны.

Бурный прогресс цитогенетики человека, биохимической генетики и особенно генетики соматических клеток в 60-х годах в комплексе с генеалогическим подходом поставил изучение генома человека на новые теоретические основы и высокий методический уровень. Обнаружение новых менделирующих признаков человека стало быстро продвигаться, особенно на биохимическом и иммунологическом уровне, появились возможности изучения сцепления и локализации генов.

Особый импульс изучению генома человека придали молекулярно-генетические методы, или технология генной инженерии (70-е годы). Процесс познания генома углубился до выделения гена в чистом виде и его секвенирования.

В отличие от классической, в новой генетике изменился подход к анализу генов. В классической генетике последовательность была следующей: идентификация менделирующего признака -> локализация гена в хромосоме (или группе сцепления) -> первичный продукт гена -> ген. В современной генетике стал возможным и обратный подход: выделение гена -> секвенирование -> первичный продукт, в связи с чем был введён новый термин для определения такого направления исследований: «обратная генетика» или «генетика наоборот».

Продолжаются совершенствование молекулярно-генетических методов и, что не менее важно, их автоматизация. В США и Великобритании были разработаны и внедрены автоматические приборы по секвенированию геномов. Их назвали геномотронами. В них осуществляется до 100 000 полимеразных реакций в час. Это означает, что в течение недели может быть просеквенирован участок (или участки) длиной в несколько миллионов пар нуклеотидов.

Большую роль в расшифровке генома человека играют вычислительная техника и информационные системы. Благодаря им решаются вопросы накопления информации (базы данных) из разных источников, хранения её и оперативного использования исследователями из разных стран.

Начальными этапами изучения генома человека можно считать разработку методов определения последовательности нуклеотидов или секвенирования ДНК (Гилберт У., Берг П., Сенджер Ф.), за которую в 1980 г была присуждена Нобелевская премия по химии. Через четыре года начались работы по полному секвенированию генома человека (Human Genome Projekt, финансированный конгрессом США - 3 млрд. долларов). К 2003 г была завершена полная расшифровка нуклеотидной последовательности генома человека. Последней была секвенирована самая большая хромосома человека (№ 1). Теперь каждый желающий теоретически может секвенировать весь свой геном за несколько минут, что обойдется ему в 1500 долларов.

В настоящее время считают, что в геноме человека 20-25 тысяч структурных генов, причем только 1% всей ДНК приходится на экзоны. Достаточно людям взглянуть друг на друга, чтобы понять, что существует генетическая вариабельность вида Homo sapiens. Структура геномов разных рас и национальностей идентична на 99,9%, а индивидуальная вариабельность составляет 0,1%. Различия между генотипами людей обусловлены в основном мутациями. Такую вариабельность и называют генетическим полиморфизмом, под которым понимают небольшие различия нуклеотидной последовательности, дающие нормальный фенотип. К полиморфизмам относят, например, однонуклеотидные замены – SNP, которые встречаются через каждые 300-400 п.о. в геноме человека. Большинство этих SNP располагаются в некодирующих участках. SNP легко идентифицировать ввиду их стабильности, и они могут использоваться в качестве маркеров для картирования генов, ответственных за такие мультифакториальные болезни, как диабет и атеросклероз. В настоящее время идентифицировано 4,0 млн. SNP, среди них значимыми внутригенными SNP являются 2,6 млн.

Следующим этапом исследования генома человека являлась программа ENCODE «Encyclopedia of DNA Elements». Геном человека или число нуклеотидов в гаплоидном наборе клетки насчитывает 3 млрд. пар оснований, из которых 10-20% являются кодирующими, а 80-90% являются некодирующими последовательностями, и поэтому основная часть ДНК не несет информацию о структуре белков, составляющих основу любого живого организма. Некодирующие последовательности представлены повторами разной протяженности, и для половины из них функции пока не известны, но предполагается, что в них содержится информация о программе индивидуального развития, которую называют партитурой «симфонии жизни». Именно она регулирует работу генов, процессинг РНК, точность матричных процессов, конъюгации и кроссинговера. Некодирующая ДНК может обеспечить компартментализацию геномов разных видов или может создавать основу для большей генетической изменчивости. Транскрибируемая часть генома составляет лишь 10%, причем из них 25% приходится на синтез РНК, и 5% транслируется до белков.

По данным ENCODE последовательности ДНК, не несущие инфрмацию о структуре белка, кодирует разные виды РНК - тРНК, рРНК и регуляторные РНК: малые интерферирующие РНК (small interfering RNA, si RNA) и микроРНК (microRNA, mi RNA). Все малые регуляторные РНК влияют на экспрессию генов на разных уровнях – синтеза РНК и посттранскрипционных модификаций, сплайсинга пре-РНК, стабилизации РНК, трансляции, они участвуют в геномном импринтинге, метилировании ДНК и ремоделировании хроматина. Действие таких РНК основано на феномене РНК-интерференции, суть которого заключается в подавлении экспрессии генов на уровне транскрипции или трансляции.

Указанные выше si RNA работают как кофакторы РНК-азных комплексов, вызывающих деградацию определенных ненужных клетке и-РНК. РНК-интерференцию можно использовать для нокдауна генов. Различают понятия «нокаут» и «нокдаун» генов. При нокауте гена индуцируются мутации, повреждающие и выключающие ген. При нокдауне гена вызывается деградация синтезированной с него и-РНК с помощью si-RNA. Введение siРНК в клетки пациентов является частью инновационной стратегии, снижающей активность генов, при лечении некоторых видов рака, гепатита и других заболеваний.

Микро РНК - mi RNA класс некодирующих шпилечных РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Структура mi-РНК закодирована в геноме, гены mi-РНК расположены в областях инвертированных повторов интронов белок - кодирующих генов, в экзонах или межгенных областях. Они могут временно выключать трансляцию белков за счет своей гибридизации с комплементарным участком и-РНК, образуя двойную спираль РНК-РНК в норме не характерную для клеток.

Кроме того обнаружены другие классы регуляторных РНК, к которым относятся - малые ядерные РНК (snRNA), участвующие в сплайсинге иРНК; теломеразные РНК; малые ядрышковые РНК (snoRNA) и рибозимы - cRNA, участвующие в модификации других РНК; длинные некодирующие РНК - lincRNA (long noncocling RNAs) с неизвестной пока функцией, содержащие примерно более 200н; piRNA (piwi - interacting RNA)- короткие молекулы длиной в 24–30 нуклеотида, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы, возможно участвующие в организации хроматина. Оказалось, что последовательности нуклеотидов piRNA комплементарны мобильным генетическим элементам и могут подавлять активность МГЭ на уровне транскрипции и репликации. Гены piRNA активны только в зародышевых клетках во время эмбриогенеза.

Все виды регуляторных РНК синтезируются с ¾ нашего генома, т.е. примерно 80,4% геномных последовательностей так или иначе участвуют в регуляторных процессах.

Оказалось, что у больных с наследственной патологией одинаковые SNP-замены расположены в генах регуляторных РНК, а не в структурных генах белков.

3. Методы изучения мутаций у человека .

В зависимости от типа мутации, которую предполагают выявить у человека, используют либо цитогенетические, либо молекулярно-генетические методы. С помощью цитогенетических методов можно выявлять у пациентов хромосомные и геномные мутации, а с помощью молекулярно-генетических – генные мутации.